Sympozium Genes, Genetics and Genomics (G3)

15. 4. 2016 v Praze

Drug resistence in chronic myeloid leukemia. Some old and new insights

Jako první přednášející Sympozia G3 2016 vystoupil prof. Michael Deininger působící na Interní klinice hematologie a hematologických malignit a Huntsman Cancer Institute na Univerzitě v Utahu se svým příspěvkem Drug resistence in chronic myeloid leukemia. Some old and new insights.

Chronická myeloidní leukémie (CML) představující zhruba 15–20 % všech leukémií patří k hemato-onkologickým onemocněním, u nichž byl v posledních desetiletích dosažen největší pokrok v léčbě s výrazným růstem mediánu pravděpodobnosti přežití nově diagnostikovaných pacientů. Vděčíme za to především zavedení vysoce účinné terapie tyrozin kinázovými inhibitory (TKI), které specificky cílí fúzní onkogenní BCR-ABL protein charakteristický pro CML a potlačují jeho aktivitu. U velké části pacientů lze pravidelným užíváním léků na bázi TKI výrazně potlačit aktivitu BCR-ABL a expresi BCR-ABL1 genu a dostat tak nemoc dlouhodobě pod kontrolu.

Zhruba 20–30 % pacientů nicméně nedosáhne v první linii léčby optimální léčebné odpovědi, především v důsledku vzniku rezistence na zvolený TKI. Pro takové pacienty představuje CML i nadále potencionálně život ohrožující diagnózu, neboť v případě nenalezení jiné vhodné léčby může nemoc postupně přejít z relativně benigní, chronické fáze do pokročilejší, akcelerované fáze a následně až do fáze tzv. blastického zvratu, kdy průběh nemoci připomíná akutní leukémii a jakákoliv dosud známá léčba je již prakticky neúčinná.

Přednáška prof. Deiningera se týkala právě mechanismů, jakými si jsou leukemické buňky schopné zabezpečit nebo vyvinout rezistenci vůči léčbě TKI, a také (nových) biomedicínských přístupů, jak tuto jejich obranu překonat.

Mechanismy rezistence buněk CML lze v obecné rovině rozdělit na BCR-ABL závislé, kdy se leukemických buňkám podaří udržet nebo obnovit aktivitu BCR-ABL proteinu a v důsledku toho se nekontrolovaně dělit, a na BCR-ABL nezávislé, kdy se sice podaří potlačit aktivitu BCR-ABL, ale buňky jsou schopné využít jiné geny a alternativní signální dráhy, aby si zajistili své přežití. Leukemické buňky mohou využívat obou těchto druhů mechanismů, nicméně se zdá, že jejich relativní význam je v různých stádiích onemocnění různý.

Kmenové a progenitorové leukemické buňky řady pacientů s CML vykazují v klidovém stavu, během něhož se nedělí, rezistenci na léčbu TKI, která jim umožňuje přežít v nepříznivém prostředí navzdory tomu, že je aktivita BCR-ABL potlačena. Takové přežívající buňky představující minimální reziduální chorobu se mohou i po dlouhodobém užívání léků stát v případě ukončení terapie zdrojem nového propuknutí nemoci. U řady rezistentních pacientů pozorujeme, že leukemické buňky přežívají a dále se dělí, třebaže aktivita BCR-ABL se vlivem léčby výrazně snížila. V těchto případech se jedná o BCR-ABL nezávislou rezistenci, která může být jak vrozená tak získaná.

V posledních letech byla identifikována řada důležitých „hráčů“ spojených s přežíváním buněk CML nezávisle na aktivitě BCR-ABL. Patří mezi ně jednak vcelku očekávaní kandidáti, kteří již byli asociováni s řadou nádorových onemocnění (některé transkripční faktory a jejich koaktivátory jako jsou např. STAT3 a β-Cathenin), tak i nově charakterizované molekuly fungující naopak v roli tumor supresorů v regulaci buněčného cyklu. Experimenty ukázaly, že zvýšením exprese těchto molekul se rezistentní leukemické kmenové buňky staly citlivé k působení TKI.

Z hlediska BCR-ABL dependentních mechanismů rezistence CML zaujímají přední místo mutace v kinázové doméně genu BCR-ABL1. Tyto mutace brání interakci TKI s molekulou BCR-ABL a zamezují potlačení jeho aktivity. Do současné doby bylo popsáno kolem stovky mutací BCR-ABL1 s vlivem na rezistenci k TKI, nicméně výrazná většina klinických případů rezistence pacientů s CML na léčbu TKI zapříčiněná mutacemi v BCR-ABL1 připadá na poměrně úzkou skupinu mutací.

Byla to právě přítomnost mutací BCR-ABL1 spojená s rezistencí vůči určitým TKI, která vedla k vyvinutí nových TKI a jejich následnému uplatnění v klinické praxi. Po 1. generaci TKI – imatinibu tak následovala 2. generace TKI – nilotinib, dasatinib a bosutinib, která úspěšně cílila většinu mutací BCR-ABL s výjimkou „super-rezistentní“ mutace T315I. Proti této mutaci byl následně vyvinut účinný TKI 3. generace – ponatinib.

Výzvu však nyní představují tzv. compound mutace, kdy jedna alela BCR-ABL1 genu v sobě nese dvě (či více) mutací najednou. V případě, že jednou z těchto mutací je T315I, jsou leukemické buňky rezistentní na všechny dosud vyvinuté TKI včetně ponatinibu. V současnosti se proto začal v klinické studii testovat nový inhibitor označovaný jako ABL001, který využívá odlišného mechanismu alosterické inhibice a v kombinaci s dosud využívanými TKI je schopen zabránit vzniku rezistentních compound mutací.

V rámci shrnutí obsahu první přednášky sympozia ohledně uplatnění mechanismů rezistence buněk CML zazněl závěr, že vliv BCR-ABL dependentních mechanismů je relativně nejvyšší v chronické fázi onemocnění, nižší v blastickém zvratu CML a nejnižší u minimální reziduální choroby. Je také zajímavé, že mnohé molekuly se shodně uplatňují jak v zajištění BCR-ABL nezávislé rezistence leukemických buněk, tak obecně v pokročilých stádiích CML, což naznačuje, že samotná rezistence představuje jeden z prvků zvýšené agresivity choroby.

Vědecké poznatky posledních let skýtají velký potenciál k úspěšnému zdolání přetrvávajících výzev v klinické praxi léčby CML a nalezení efektivní léčby šité na míru individuálním pacientům.

Variation of gene expression during normal hematopoiesis

Druhým přednášejícím Sympozia G3 byl prof. Eric Bouhassira z Oddělení buněčné biologie a medicíny na Albert Einstein College of Medicine v New Yorku s příspěvkem Variation of gene expression during normal hematopoiesis. Přednáška prof. Bouhassira se zabývala zejména aspekty DNA replikace, které následně ovlivňují genovou expresi a základní životní procesy buněk, jako je jejich dělení nebo diferenciace spojená se získáním specializovaných funkcí.

Lidská krvetvorba je pěkným příkladem biologického procesu, kdy z jediné, nediferencované tzv. krvetvorné kmenové buňky schopné sebeobnovy a diferenciace může na základě alternativních genově-expresních programů vzniknout v postupných krocích řada různých buněčných elementů přítomných v periferní krvi, jako jsou červené krvinky, B a T lymfocyty, granulocyty nebo krevní destičky.

Avšak vedle rozdílů v genové expresi, které se projevují vznikem specializovaných buněk různých krevních řad, se ukázalo, že také jednotlivé buňky stejného typu nezapínají (resp. nevypínají) vždycky stejné geny nebo jejich expresi regulují v různé míře, čili že genová exprese je ve skutečnosti individualizovaná na úrovni jednotlivých buněk. Tak například hladiny hemoglobinu se v jednotlivých červených krvinkách liší buňka od buňky a tyto rozdíly přitom nelze vystopovat na úrovni jejich společných progenitorů. Přitom bylo zjištěno, že právě tato různorodost genové exprese na úrovni buněk je v lidské krvetvorbě normálním fyziologickým stavem, zatímco ve stáří, ale také v případě nemocí krvetvorby, jakými jsou třeba leukémie nebo myelodysplastický syndrom, se tato variabilita snižuje, a to někdy až na jediný expresní profil – hovoříme pak o monoklonální krvetvorbě.

O příčinách expresní variability na úrovni buněk u zdravých jedinců toho zatím příliš mnoho nevíme. Až do nedávna se většina studia genové exprese v určitém typu buněk odehrávala na úrovni zkoumání populací čítajících tisíce a více buněk, takže výsledný obrázek byl vlastně statisticky zprůměrovaný agregát zastírající veškeré individuální rozdíly. V dnešní době se již vědci umí podívat na úroveň jedné buňky a dokonce umí rozlišit mezi expresí každé ze dvou konkrétních alel určitého genu na našich párových chromozomech. Díky tomu se pokročilo také ve studiu mechanismů, které za tyto rozdíly zodpovídají.

Jak již bylo řečeno úvodem, v přednášce se poukázalo především na zajímavou souvislost mezi replikací buněčné DNA a genovou expresí. K replikaci neboli zkopírování DNA dochází v rámci určité fáze buněčného cyklu označované jako S fáze coby přípravě na následné jaderné a buněčné dělení. Dynamika replikace přitom může ovlivnit, v jakém stavu se vlákno DNA dostane do dceřiné buňky a jak bude přístupné transkripčním faktorům regulujícím genovou expresi.

Úseky DNA obsahující aktivní geny jsou obecně replikovány v časné S fázi, geny neaktivní jsou replikovány podle toho, zda se nacházejí nebo nenacházejí v blízkosti aktivních genů a rozsáhlé úseky DNA neobsahující žádné geny nebo obsahující striktně vypnuté geny, tzv. heterochromatin, se replikují až v pozdní S fázi buněčného cyklu.

Tím ale příběh o spojení replikace DNA a genové exprese nekončí, protože rozdíly v genové expresi existují i na úrovni alel. Velká většina genomu, cca 88–90 % je replikována synchronně ve smyslu, že obě alely jednoho genu se replikují v přibližně stejnou dobu. Zhruba 12 % genomu je nicméně replikováno asynchronně – úsek DNA zahrnující alelu genu na jednom z párových chromozomů je replikován v časné S fázi, zatímco úsek zahrnující alelu na druhém chromozomu je replikován v pozdní S fázi.

Ukázalo se, že asynchronní replikace DNA se výrazně častěji vyskytuje u genů, u kterých probíhá exprese pouze z jedné alely. Tento jev, kterého se ale účastní i řada dalších mechanismů, lze pozorovat na úrovni celých chromozomů – konkrétně při inaktivaci jednoho ze dvou chromozomů X v buňce (u XX genotypu), na úrovni jednotlivých genů specificky zapnutých nebo vypnutých podle toho, zda byly zděděny od otce nebo od matky – což se označuje jako genový imprinting (např. gen IGF2 pro Insulin-like growth factor 2 je preferenčně zapínán z otcovské alely), nebo u některých genů, které jsou také zapínány pouze z jedné alely, ale to, zda půjde o alelu zděděnou od otce nebo od matky, je náhodné. Asynchronně replikované úseky DNA jsou organizovány do velkých domén, přičemž je zajímavé, že takové úseky obsahují průměrně více míst počátku replikace než úseky replikované synchronně.

Závěrem je nutné zdůraznit, že výše zmíněné mechanismy se podílejí na variabilitě genové exprese na úrovni buněk, kde jejich bezchybná, organizovaná regulace je často zásadní pro správný průběh životních dějů. Například poruchy genového imprintingu, v jejichž důsledku dochází k expresi z obou alel místo z jediné, byly identifikovány u řady lidských malignit.  

Poděkování

Sympozium G3 2016 vzbudilo podobně jako v minulých letech nemalý zájem domácích vědeckých pracovníků. O kvalitě sympozia svědčila i bohatá diskuze k jednotlivým sdělením. Zájemci o podrobnější informace o Genes, Genetics & Genomics, mohou kontaktovat organizátory sympozia prof. Tomáše Stopku nebo dr. Kateřinu Machovou Polákovou na e-mailových adresách: tstopka@lf1.cuni.cz; katerina.machova@uhkt.cz.

Organizátoři by tímto také rádi poděkovali sponzorům letošního sympozia: firmám Novartis, Bristol-Myers Squibb, Roche, KRD, Eppendorf a Sigma-Aldrich za poskytnutou finanční podporu, bez které by nebylo možné sympozium uspořádat a pozvat takto významné hosty.

• Autor zprávy: Dr. Nikola Čuřík