Skupina pro vyšetřování buněčného chimerismu

Vyšetření buněčného chimerismu u pacientů po alogenní transplantaci kmenových hematopoetických buněk (HSCT) se provádí od roku 1992 a to pro potřeby pacientů ÚHKT, Kliniky dětské hematologie a onkologie FN Motol a dalších klinických zadavatelů.

Princip určení typu buněčného chimerismu vychází ze skutečnosti, že každý člověk má unikátní strukturu DNA, kterou tvoří soubor multialelických, vysoce variabilních polymorfismů, zejména typů Short tandem repeat (STR), single nukleotid polymorphism (SNP) a krátkých inzercí a delecí (indel) lokalizovaných v nekódujících oblastech DNA. Díky mimořádnému rozlišovacímu potenciálu těchto markérů je výsledkem srovnání DNA příjemce a dárce nalezení informativních polymorfismů DNA, na základě kterých lze rozlišit původ buněk v každém případě, i když se většinou jedná o sourozence, či jiné blízké příbuzné.

Molekulární analýza individuálního buněčného chimerismu v daném časovém bodě po HSCT je pak nespecifickým markérem posttransplantační krvetvorby pro všechny diagnózy s cílem poskytnout co nejpřesvědčivější diagnostické podklady pro klinická rozhodnutí.

Stanovením genotypů informativních polymorfismů DNA z buněk krve či kostní dřeně pacienta po transplantaci je možné sledovat přihojení, přežívání a množení dárcovských buněk svědčící o její úspěšnosti. Využívají se i v případech přítomnosti maternálního engraftmentu a v některých buněčných frakcích při poruchách imunity. Velká citlivost vyšetření je výhodou zejména v bezprostředním období po transplantaci a je důležitá i pro zachycení prvních známek návratu původní krvetvorby.

Opětovné se objevení a nárůst počtu krevních buněk s charakteristickými znaky DNA pacienta (autologní krvetvorba) na úkor buněk typických pro dárce (alogenní krvetvorba) naznačuje riziko návratu nemoci a možnost odhojení štěpu, čemuž je potřebné předcházet včasným léčebným zásahem, učiněným i na základě vyšetření buněčného chimerismu.

Pro genotypizaci a kvantifikaci používáme řadu přesných metodik:

• Vyšetření genotypů sekvenčních polymorfismů typu STR založené na metodě jednorázové multiplex nebo monoplex polymerázové řetězové reakci (PCR) daného počtu vybraných délkových polymorfismů DNA typu STR a amelogeninu a jednorázové multiplex polymerázové řetězové reakci (PCR) daného počtu vybraných DIP polymorfismů DNA typu HLD (Human Locus DIP) a amelogeninu použitím startovacích oligonukleotidů značených fluorescenčním barvivem a následném rozdělení fragmentů pomocí fragmentační analýzy - metoda akreditovaná ČIA o.p.s. v Praze
• Vyšetření genotypů sekvenčních polymorfismů typu SNP a indel založené na metodě kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qPCR, real-time PCR). Používaná metoda využívá tzv. TaqMan technologii. Umožňuje přesnou kvantifikaci amplifikačních produktů detekcí fluorescence uvolněné během exponenciální fáze reakce. Intenzita fluorescence je přímo úměrná množství vznikajícího produktu - metoda akreditovaná ČIA o.p.s. v Praze

• Stanovení genotypů sekvenčních polymorfismů slouží k identifikaci buněčné populace (postup A) a eventuelně poté následuje kvantitativní stanovení jednotlivých buněčných populací obsažených ve vzorku (postup B). Pro identifikaci a kvantifikaci využívá polymorfismů typu short tandem repeats (STR), jednonukleotidových polymorfismů (SNP) a krátkých inzercí a delecí (indels) pomocí fragmentační analýzy nebo kvantitativní real-time PCR.

Jedná se o rychlé, velmi efektivní a citlivé metody, umožňující intenzivní monitorování harmonogramu pacientů léčených transplantací krvetvorných buněk.

Pro kvantitativní vyšetření buněčného chimerismu pořádá laboratoř pro zájemce každoroční program MPZ.

Skupina buněčného chimerismu také pravidelně 1x ročně zajišťuje na mezinárodní úrovni kontrolu kvality: Zkoušení způsobilosti pro oblast kvantitativního vyšetření buněčného chimerizmu.