TEST KITU FIRMY ABBOTT: Abbott RealTime High Risk HPV

Abbott RealTime High Risk HPV je kvalitativní test na detekci DNA 14 vysokorizikových genotypů lidských papillomavirů (HPV) 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68 v klinických vzorcích. Test umožňuje zároveň genotypizaci HPV16 a HPV18. Metoda Abbott RealTime HR HPV je založena na extrakci DNA pomocí přístroje Abbott m2000sp, popř. Abbott m24sp nebo na metodě manuální přípravy vzorků pro následnou amplifikaci a detekci HPV DNA v reálném čase. Ta se provádí pomocí přístroje Abbott m2000rt. Systém Abbott mSample Preparation SystemDNA pro manuální izolaci vzorků využívá techniku magnetických částic na zachycení nukleových kyselin, po přečištění a eluci je izolovaná DNA použita pro amplifikaci.

Směs primerů pro amplifikaci obsahuje tři přední primery a dva zpětné primery, amplifikující konzervovanou L1 oblast HPV genomu. Signál pro čtrnáct genotypů HR HPV (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) se generuje pomocí fluorescenčně značených sond. Amplikony interní kontroly (IC) jsou generovány sadou primerů, zaměřených na sekvenci endogenního lidského beta-globinu a detekují se pomocí IC specifické sondy. Sondy pro genotypy HPV 16, HPV 18, non-HPV 16/18 (jiné HR HPV) a IC jsou značeny různými fluorofory, které umožňují rozlišení jejich signálů v jedné reakci. Test je určen pro detekci HPV z odběrového média PreservCyt (Cytyc Corporation).

Test má CE certifikát z roku 2008.

Provedení:

Testovali jsme jednu soupravu pro manuální přípravu vzorků mSample Preparation SystemDNA a soupravu Abbott RealTime High Risk HPV Amplification Reagent Kit, která obsahuje soubor reagencií pro amplifikaci. Součástí testu byla také souprava pozitivních a negativních kontrol - Abbott RealTime High Risk HPV Control Kit. Celkem jsme izolovali 31 vzorků odebraných do média PreservCyt a dvě negativní a dvě pozitivní kontroly dodané firmou pomocí soupravy mSample Preparation SystemDNA dle firemního protokolu. Čtrnáct vzorků použitých pro amplifikaci byly vzorky z banky NRL pro PV se stanoveným typem HPV a koncentrací HPV (HPV genome equivalents (IU) per 5 μl). Tyto vzorky již obsahovaly izolovanou DNA. Celkem jsme HPV DNA detekovali u 45 vzorků a u pozitivní a negativní kontroly z Abbott RealTime High Risk HPV Control Kitu. Amplifikace byla provedena jedním kitem Abbott RealTime High Risk HPV Amplification Reagent Kit podle firemního protokolu ve dvou různých dnech, test byl proveden dvěma pracovníky NRL pro PV (RNDr. Martina Saláková, Ph.D., RNDr. Jana Šmahelová).

Výsledky jsme porovnali s dalšími metodami HPV detekce (Hybrid Capture II Digene firmy Qiagen, LinearArray HPV Test firmy Roche, Aptima HPV Test firmy GenProbe).

Hodnocení:

Manuál

Firemní manuál je velmi dobře napsaný ve smyslu správné laboratorní praxe s ohledem na bezpečnost práce a prevence potenciálních kontaminací. Manuál obsahuje velmi podrobné informace, jak pracovat s infekčním materiálem a jak pracovat s citlivou metodou PCR v reálném čase (qPCR). Manuál obsahuje popis amplifikace pomocí metody manuální přípravy vzorků i pomocí přístrojů m24sp a m2000s, je však poměrně obsáhlý, což je na úkor jeho přehlednosti. Protokol pro izolaci DNA není součástí protokolu pro amplifikaci pomocí metody manuální přípravy vzorků, ale je dodáván samostatně. S výhodou by bylo dodání i zkráceného návodu.

Izolace

Izolace pomocí magnetických kuliček je časově i pracností srovnatelná s kolonkovou izolací (např. fy Qiagen).

Amplifikace

Samotná amplifikace je poměrně jednoduchá. V daném kroku se připravuje směs pro PCR smícháním předepsaných objemů třech složek. Tato směs se dále pipetuje do jamiček mikrotitrační destičky, dále se přidají vyšetřované vzorky a destička se vloží do přístroje. Jako jedinou nevýhodu vidíme to, že plastové lahvičky reagencií nelze vyndat z krabičky a není tedy možná kontrola obsahu lahvičky (rozmrazení reagencie, výška hladiny pro pipetování).

Výsledky:

Celkově jsme vyšetřili 45 vzorků. Vyšetření bylo opakované dvakrát, ve dvou různých dnech a dvěma operátory za použití stejného kitu. Reprodukovatelnost byla velmi dobrá (průměrný CV byl 1,17% (rozmezí 0,04 – 3,95). Pouze jeden vzorek byl pozitivní v jednom opakování a v druhém negativní.

Srovnání charakteristik testu jsme provedli s testem HR HCII (Qiagen). Specificitu a citlivost jsme vyhodnocovali pro 31 vzorků, které byly též vyšetřené HR HCII setem (Tabulka č.1) a setem AptimaHPV (GenProbe) (data neuvedena).

Tabulka č. 1:

Citlivost byla 96,2%, specificita 80,0%, pozitivní prediktivní hodnota (PPV) 96,2% a negativní prediktivní hodnota (NPV) 80%. Korelační koeficient 0,7615 odpovídá slovnímu hodnocení význačný.

U 31 vzorků byl známý i histologický nález u pacientek v době odběru. Citlivost testu Abbott RealTime High Risk HPV pro nálezy CIN 1 byla 60% (HR HCII 50%), pro nálezy CIN 2+ 95% (HR HCII 100%).

Typová specificita testu byla velmi dobrá. Test správně určil přítomnost HPV typu 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 s citlivostí odpovídající požadovaným hodnotám pro splnění tzv. „proficiency“ definovanou WHO Global HPV Reference Laboratory na 500 IU pro výše zmíněné typy HPV. Pro typ HPV 16 a 18 je podmínka „proficiency“ stanovená na 50 IU. Test Abbott detekoval pouze jednou HPV 16 v této koncentraci jako pozitivní, při opakovaném testování byl vzorek negativní, což jasně ukazuje, že tato koncentrace je na hranicvi či spíše těsně pod hranicí detekční schopnosti kitu.Vzorek obsahující HPV 18 byl negativní při obou opakování. Testovaný set není schopen detekovat HPV 68 a (prototyp) podobně jako systémy založené na primerech odvozených od PYGMY11/09.

Závěr:

Test hodnotíme jako uživatelsky velmi přátelský. Umožňuje rychlou přípravu vzorků a následnou amplifikaci a detekci 14 HR HPV typů a odlišení genotypů HPV16 a 18 a automatické vyhodnocení výsledků reakce. Test je možné provádět na DNA izolované manuelně nebo strojově. Při použití přístrojů m24sp resp m2000s pro přípravu vzorků lze test Abbott RealTime High Risk HPV doporučit spíše do laboratoří s větším objemem zpracovávaných materiálů.

Vzhledem k tomu, že se jedná o test amplifikační, vyžaduje jeho provádění oddělené prostory pro pre- a post-amplifikační fázi. Test umožňuje zpracovávat vzorky odebrané do komerčně dostupného média PreservCyt (PC, Cytyc, Boxborough, MA, USA). Manuál testu je dobrý, pouze by bylo s výhodou doplnit jej o zkrácený návod.

Citlivost a specificita testu je srovnatelná s testem HR HC II. Jeho klinická citlivost pro detekci CIN2+ je o něco málo nižší (95% vs. 100%) než HR HCII.

Jeho analytická, ale především i klinická citlivost byla testována již v řadě studií (Poljak et al., 2009, 2011; Wong et al., 2011; Carozzi et al., 2011Halfn et al., 2010; Cuzick et al., 2010; Huang et al., 2009), které shodně ukazují na jeho vhodnost pro použití ve screeningu pro karcinom hrdla děložního.

Z hlediska citlivosti pro různé typy HPV, vykazuje nižší citlivost pro HPV 16 a 18, než některé jiné metody, jak je možné přehledně porovnat v WHO HPV LabNet Report on HPV DNA Proficiency Panel (Eklund a tel., 2010). Stejně jako další systémy založené na amplifikaci pomocí primerů PYGMY11/09 či od nich odvozených primerů, není tento set schopný detekovat HPV 68a (prototyp).

Souhrnně lze test označit za vhodný pro použití ve  screeningu. Otázka využití typizace tohoto testu ve screeningu přináší aditivní hodnotu, ale pro některé specifické případy vyžadující citlivou metodu HPV typizace je třeba vzít v úvahu jeho nižší citlivost pro detekci HPV 16/18 ve srovnání s dalšími typizačními metodami pro HPV.

RNDr. Ruth Tachezy, Ph.D.
vedoucí NRL pro papillomaviry
ÚHKT, Praha
V Praze, 15. 9. 2011

Mgr. Markéta Váňová
Key Account Manager CZ, SK, HU
Abbott Molecular, Praha
V Praze, 4. 10. 2011

Literatura:

Carozzi FM, Burroni E, Bisanzi S, Puliti D, Confortini M, Giorgi Rossi P, Sani C, Scalisi A, Chini F. (2011) Comparison of clinical performance of Abbott RealTime High Risk HPV test with that of hybrid capture 2 assay in a screening setting. J Clin Microbiol. 49(4):1446-51.

Cuzick J, Ambroisine L, Cadman L, Austin J, Ho L, Terry G, Liddle S, Dina R, McCarthy J, Buckley H, Bergeron C, Soutter WP, Lyons D, Szarewski A. (2010) Performance of the Abbott RealTime high-risk HPV test in women with abnormal cervical cytology smears. J Med Virol. 82(7):1186-91.

Eklund C, Zhou T, Dillner J (2010) Global proficiency study of human papillomavirus genotyping. J Clin Microbiol 48: 4147–4155.

Halfon P, Benmoura D, Agostini A, Khiri H, Penaranda G, Martineau A, Blanc B. (2010) Evaluation of the clinical performance of the Abbott RealTime High-Risk HPV for carcinogenic HPV detection. J Clin Virol. 48(4):246-50.

Huang S, Erickson B, Tang N, Mak WB, Salituro J, Robinson J, Abravaya K. (2009) Clinical performance of Abbott RealTime High Risk HPV test for detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia in women with abnormal cytology. J Clin Virol. 45 Suppl 1:S19-23.

Poljak M, Kovanda A, Kocjan BJ, Seme K, Jancar N, Vrtacnik-Bokal E (2009) The Abbott RealTime High Risk HPV test: comparative evaluation of analytical specificity and clinical sensitivity for cervical carcinoma and CIN 3 lesions with the Hybrid Capture 2 HPV DNA test. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat. 18(3):94-103.

Poljak M, Ostrbenk A, Seme K, Ucakar V, Hillemanns P, Bokal EV, Jancar N, Klavs (2011) Comparison of clinical and analytical performance of the Abbott Realtime High Risk HPV test to the performance of hybrid capture 2 in population-based cervical cancer screening. J Clin Microbiol. 49(5):1721-9.

Wong OG, Lo CK, Szeto E, Cheung AN. (2011) Efficacy of Abbott RealTime High Risk HPV test in evaluation of atypical squamous cells of undetermined significance from an Asian screening population. J Clin Virol. 51(2):136-8.