AMPLICOR® HPV test firmy Roche

Princip metody:

Set AMPLICOR® HPV vyráběný firmou Roche je určený pro detekci vysoko-rizikových typů lidských papillomavirů (HR HPV) ve stěrech z hrdla děložního. Test detekuje13 HR HPV typů, HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 a 68. Test AMPLICOR HPV zahrnuje izolaci DNA, amplifikaci cílové DNA pomocí PCR, hybridizaci PCR produktů s oligonukleotidovými próbami a kolorimetrické určení produktů. AMPLICOR HPV PCR amplifikuje fragment z vysoce konzervované oblasti L1 genu HPV o velikosti 165 pb za použití primerů značených biotinem. V setu jsou zařazené i primery pro amplifikaci vnitřní kontroly – 268pb dlouhou oblast lidského ß-globinového. Produkt amplifikační reakce je následně použit k obrácené hybridizaci, při které je oligopróba specifická pro skupinu HR HPV a ß-globinový gen pevně ukotvená na jamky mikrotitrační destičky. Součástí testu jsou odběrové zkumavky PreservCytTM a kit na izolaci DNA od firmy Qiagen. PCR produkt je denaturován a hybridizován k specifické próbě na dně jamičky. PCR produkt specificky navázaný na specifickou próbu je detekován přes biotin streptavidin-konjugovanou protilátkou s křenovou peroxidázou (HRP, horse-radish peroxidase) a vizualizován barevnou reakcí substrátu obsahujícího hydrogen peroxidázu a 3,3’,5,5’-tetramethylbenzedine.

Obr.: Princip testu AMPLICOR® HPV

Hodnocení NRL:

Výsledky testování AMPLICOR HPV kitu firmy Roche pro HPV typy, které udává výrobce v naší laboratoři ukázaly jeho dobrou citlivost, reprodukovatelnost i specifitu. Kit je evidentně schopný zachytit i jiné HR typy a pravděpodobnost tohoto záchytu roste s virovou náloží. To však ve své podstatě není chybou, neboť čím širší spektrum HR HPV typů je set schopný zachytit, tím roste i pravděpodobnost zachycení lezí závažného stupně. Limitaci kitu spatřujeme v metodě izolace, která je poměrně zdlouhavá, zvláště pokud by tento set byl používán pro detekci 96 vzorků najednou. Izolace by pak byla i náročná z hlediska soustředění se na možnost kontaminace mezi vzorky. Je nezbytné doplnit série vyšetřovaných vzorků negativními kontrolami izolace.
Vlastní amplifikace je poměrně jednoduchá. Je nezbytné z hlediska možné kontaminace a z hlediska dalšího kroku (detekce) používat stripové zkumavky, na což výrobce setu neupozorňuje. Je možné provádět detekci HPV tímto setem i u vzorků odebraných do STM média. K izolaci stačí 100 ěl vzorku doplněného 10 mM Tris-Cl pH 7,4. Dle našich zkušeností není třeba v případě použití termocyklerů schopných vychladit vzorky po dokončení amplifikační reakce na +4°C třeba dodržovat čas k zahájení detekce 1 hodinu po doběhnutí reakce. Doporučujeme vylepšit překlad návodu do českého jazyka a návod též zjednodušit a doplnit dle uvedených připomínek.
Vzhledem k omezenému množství vzorků, jsme neprováděli zjištění eventuální falešně pozitivní reakce při vysoké náloži LR HPV.
Provádění testu na termocykleru PTC 200 (MJ Research Inc.) ukázalo shodné výsledky s použitím doporučovaného termocykleru GeneAmp PCR 9700.
Tento set lze doporučit k použití na našem trhu, avšak spíše pro laboratoře s menším objemem vyšetřovaných vzorků a především takových, které disponují prostorovým, technickým vybavením a zkušeným personálem k zabezpečení provádění náročných molekulárně biologických technik.

Od zimy 2005 testujeme využití automatu MagNA Pure Compact pro izolaci DNA z krve a buněk. Přístroj zpracovává najednou 8 vzorků za 20-40 minut. Jeho použití je velmi jednoduché. Srovnání na větším souboru materiálů nemáme k dispozici, ale vzorky izolované s jeho použitím se amplifikují bez problémů.
Jeho větší verze se jmenuje MagNA Pure LC Instrument a zpracovává 32 vzorků za 60-180 minut.

Na žádost firmy Roche jsme v NRL PV v roce 2006 provedli srovnávací studii využití různých odběrových souprav (PreservCyt medium od fy Cytyc a Specimen Transport Medium od fy Digene) a postupů pro přípravu vzorků pro diagnostický set AMPLICOR® HPV.

• Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR® HPV test firmy Roche