NRL_10_SOP_14_01 Vyšetření množství transkriptů mutovaného genu NPM1 pomocí real-time RT-PCR u pacientů s AML

Monitorování exprese mutovaného genu NPM1

Periferní krev a kostní dřeň se standardně odebírá do protisrážlivého roztoku EDTA, případně ACD. Nelze použít vzorky odebrané do heparinu (heparin inhibuje PCR reakce, vyšetření tedy nelze provést z takto odebraných vzorků). Pro vyšetření lze přijímat i jiný biologický materiál dle specifikací uvedených pro jednotlivá vyšetření v záložce vyšetřovaný materiál

Vzorek musí být pro přepravu zabezpečen tak, aby nemohlo dojít k rozlití, potřísnění biologickým materiálem nebo jinému znehodnocení vzorku. Vzorek periferní krve/kostní dřeně by měl být doručen do laboratoře co nejdříve po jeho odběru. Maximální doba uchování a transportu vzorků periferní krve/kostní dřeně je dva dny od náběru. Není zapotřebí zvláštních opatření pro transport, vzorek se pouze nesmí vystavit zahřátí (např. vystavení slunci, držení v ruce apod.). Přesahuje-li doba od náběru 3 hodiny, je vhodné jej transportovat při 4°C. Při této teplotě je možné jej skladovat až 2 dny. Transport vzorku zajišťuje zadavatel a odpovídá za něj. Laboratoř nekontroluje hodinu odběru. Systém vnitřní kontroly vyšetřovaných vzorků je totiž na laboratoři nastaven tak, aby odhalil pochybení v kvalitě vyšetřovaného materiálu. Specifikace uchování a přepravy pro jiný biologický materiál, který může být použit pro jednotlivá vyšetření, je uvedena v v záložce vyšetřovaný materiál.

Nutným předpokladem úspěšného vyšetření primárního vzorku je přítomnost dostatečného množství jaderných buněk v odebíraném vzorku. Dále záleží, jestli následná naše kvantifikace referenčního genu ABL neklesne pod minimální vyžadovanou mez. V tomto případě může dojít ke zvýšení či snížení skutečného počtu kopií mutovaného genu NPM1. Krev musí být odebrána do protisrážlivého roztoku. Nejlepším antikoagulans je citrát, případně s glukózou (ACD apod.). Pro krátkodobé předání vzorku je možný odběr do chelatonu (EDTA). Nelze použít heparin – inhibuje PCR. Rušivým vlivem při izolaci leukocytů z periferní krve, popř. z kostní dřeně je snížená odolnost leukocytů, která snižuje výtěžnost metody. Také se někdy vyskytuje zvýšená odolnost erytrocytů k lyzaci, což znemožňuje získat čistý vzorek leukocytů. Obecně jsou, ale rušivé vlivy dány vlastností dodaného vzorku, kterou nemůžeme ovlivnit. Při izolaci RNA a reverzní transkripci jsou kritickými body metody voda a ostatní materiály, které by měly být RNA kvality a dále zabránění kontaminací RNAázami. Je třeba dobře odsát zbytek etanolu před rozpouštěním ve vodě a zároveň neodsát sediment – RNA. Rozpuštěnou RNA a následně i cDNA je nutno dlouhodobě skladovat při -80°C.

Veškerá vyšetření lze provést pouze na základě informovaného souhlasu pacienta.

21.12.2024

Laboratorní příručka
Příloha laboratorní příručky č. 1 (pdf)
Informace pro pacienty: Exprese WT1 a NPM1
Informovaný souhlas s genetickým laboratorním vyšetřením